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Barnes型Barnes迷宫视频分析系统 |
Barnes迷宫视频分析系统由一个圆形平台构成，在平台的周边，布满了很多穿透平台的小洞。平台的直径、厚度以及洞口宽度根据实验动物不同而不同。洞口数目由实验者习惯而定，一般为10到30个。在其中一个洞的底部放置有一个盒子，作为实验动物的躲避场所；其它洞的底部是空的，试验动物无法进入其中。实验场所和其它迷宫实验场所类似，要求能给实验动物提供视觉参考物。实验方案根据实验者的习惯以及不同的实验要求而定，每次训练后都用70%的酒精进行清洗，并变换正确的洞口，但洞口的空间位置不变，以防止动物通过嗅觉而找到洞口。Barnes迷宫一般采用强光、噪声以及风吹等刺激作为实验动物进入躲避洞口的动机。
观察指标：测定动物对于目标的空间记忆能力。实验时把实验动物放置在高台的中央，记录实验动物找到正确洞口的时间，以及进入错误洞口的次数以反应动物的空间参考记忆能力。也可以通过记录动物重复进入错误的洞口数来测量动物的工作记忆。
优点：不需要食物剥夺和足底电击，因此对动物的应激较小。实验对于动物的体力要求很小，能最低限度的减少因年龄因素所致的体力下降对实验结果的影响。实验所需时间较少，整个实验能在7~17
天内完成。能防止动物凭借气味来完成实验
指标参数
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采集指标 |
观察时间，潜伏期时间,错误次数,轨迹图等 |
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大鼠迷宫规格 |
直径120cm，高100cm |
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小鼠迷宫规格 |
直径80cm
，高100cm |
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大鼠洞数 |
18个洞 直径10cm |
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小鼠洞数 |
18个洞 直径5cm |
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迷宫材料 |
医用PVC或 亚克利 |
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旋转角度 |
360度可旋转 |
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逃避盒位置 |
每个洞均有固定槽，可更换位置 |
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摄像系统参数 |
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摄像机品牌 |
SONY枪式摄像机 |
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色彩 |
黑白或彩色 |
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清晰度 |
540线/600线 |
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最低照度 |
<0.005Lux |
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视频采集卡 |
USB2.0外置式 |
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α犆犪犕犓犐犐在前脑过量表达损伤小鼠灵活性学习能力 安述明， 曾庆文， 徐 浩， 刘汝清， 曹晓华
（华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室上海市科学技术委员会重点实验室，上海 ２０００６２） |
摘要：将３月龄实验小鼠分为αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 转基因组和同窝野生对照组，进行疲劳转棒实验
和Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验测试．结果显示，转基因组小鼠的体力和运动协调能力与对照组相比无显
著的差异；在Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验的可视平台测试中，转基因鼠的视觉和求生的动机表现正常；
在定位航行训练和第一次空间探索测试中，两组鼠在训练时逃避潜伏期及测试中在目标象限探
索时间无统计学差异；但是在反向定位空间学习阶段，转基因组在第二、三天逃避潜伏期和距离
明显长于同窝对照组（犘＜０．０５）．由此认为，αＣａＭＫＩＩ在前脑过量表达对小鼠的灵活性学习有
损伤作用，推测这种损伤有可能由前脑ＬＴＤ 的缺陷造成的．
关键词：钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ； 疲劳转棒实验； Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验； ＬＴＤ；
空间再学习
中图分类号：Ｑ６ 文献标识码：Ａ
收稿日期：２００９０３
基金项目：国家自然科学基金（３０６７０６８２）
第一作者：安述明，男，硕士研究生，研究方向为学习与记忆．
通讯作者：曹晓华，女，教授，研究方向为学习与记忆．Ｅｍａｉｌ：ｘｈｃａｏ＠ｂｒａｉｎ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
０引 言
钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（ＣａＭＫＩＩ）在学习与记忆和突触可塑性中发挥着重要的作用［１４］．在大脑中ＣａＭＫＩＩ主要存在形式是α亚型［１］．突触中富含这种激酶，它还是突触后致密蛋白（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｄｅｎｓｉｔｙ）的主要成份［１］．大量的研究证明αＣａＭＫＩＩ和多种类型的记忆有关．利用基因工程的方法，敲除小鼠海马中αＣａＭＫＩＩ，将严重损伤其空间记忆［５，６］．而αＣａＭＫＩＩ的过量表达也会降低转基因鼠在Ｍｏｒｒｉｓ
水迷宫［７９］和Ｂａｒｎｅｓ迷宫［４，１０］空间学习中的成绩．不管是敲除还是过量表达αＣａＭＫＩＩ基因，小鼠的条件恐惧记忆（Ｆｅａｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｍｅｍｏｒｙ）都会受损［７，８，１０１３］．ＪｏｅＺＴｓｉｅｎ博士带领科研小组发展了第四代基因敲除技术（可诱导的、可逆的和区域特异性蛋白敲除技术），使用αＣａＭＫｉｎａｓｅⅡ启动子，成功创建出蛋白修饰的αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 转基因小鼠实现了αＣａＭＫⅡ基因在前脑皮层、海马和杏仁核等区域过量表达［１３］．在新异物体识别任务中，αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 和ＣａＭＫＩＩＡｓｐ２８６ＥＣ
转基因鼠的识别记忆受损［９，１１１３］．以往的研究多集中于αＣａＭＫＩＩ在一种固定规则学习任务中的作用，但是αＣａＭＫＩＩ在非固定规则学习任务即学习灵活性中的作用却少有关注．因此，本研究选取Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫(Barnes迷宫视频分析系统,Barnes迷宫,迷宫视频分析系统)空间学习记忆任务，再次利用蛋白修饰的αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 转基因鼠［１３］研究αＣａＭＫＩＩ在前脑过量表达对于灵活性学习影响．
１ 材料与方法
１．１ 实验动物
从美国普林斯顿大学引进αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 转基因小鼠多只．在华东师范大学脑功能基因组学研究所动物中心饲养和繁殖．用αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 转基因雄性小鼠与Ｂ６／ＣＢＡＦ１雌性小鼠交配和繁殖．２８ｄ后检测小鼠的基因型，分笼．每笼３～４只，自由摄食，饮水，自动光控（１２Ｌ／１２Ｄ 昼夜交替），每日７：００～１９：００ 开灯，１９：００～ 次日７：００
熄灯．行为学实验均在９：００～１８：００内进行，室温（２２±２）℃，相对湿度５０％～６０％．
１．２ 仪器设备
Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫(Barnes迷宫视频分析系统,Barnes迷宫,迷宫视频分析系统)实验装置及其追踪分析系统购买自美国ＣｏｕｌＢｏｕｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ公司．
疲劳转棒实验装置及其分析系统
１．３ 方法
１．３．１ 疲劳转棒实验（Ｒｏｔａｒｏｄｔｅｓｔ）（转棒式疲劳仪）
实验装置有５个隔间，每个隔间的宽度为６．５ｃｍ．每个隔间有红外探测和独立的测量系统装置，能检测到小鼠的跌落情况．程序化控制转棒仪的转速，速度范围在１～１００ｒ／ｍｉｎ，转棒既能匀加速也能匀减速的转动．疲劳转棒测试系统主要包括转棒仪、软件控制系统和数据采集分析系统．
实验前三天为习惯阶段．每天抚摸鼠５ｍｉｎ，以消除实验鼠的紧张状态．随后，小鼠被放置在隔间的转棒上，控制转棒旋转５ｍｉｎ，让小鼠适应新的环境和运动方式．每５只鼠测试结束后，用７５％的酒精擦拭测试隔间，以避免气味的干扰．测试阶段，操作方法同习惯阶段．小鼠分别放置在隔间的转棒上，运转５ｍｉｎ，转棒的速度从１到３０ｒ／ｍｉｎ匀加速增加，记录小鼠在转棒上爬行的总路程和平均速度．
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第２期安述明，等：αＣａＭＫＩＩ在前脑过量表达损伤小鼠灵活性学习能力
１．３．２ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅ）(Barnes迷宫视频分析系统,Barnes迷宫,迷宫视频分析系统)
水迷宫实验装置为一圆柱形水池，直径１．５ｍ，高５４ｃｍ，平台直径１０ｃｍ，平台可升降．在水池边缘上等距离设４个标记点，将水池等分为４个象限，平台置于任意一个象限的中央．每个象限的边１／２弧度处标记为小鼠入水点．水池内加入白色颜料，平台在水面下１ｃｍ处，在实验时小鼠无法看到平台．水温维持在（２５±１）℃．实验期间迷宫四周参照物保持不变．水迷宫实验系统包括ＣＣＤ 摄像头、视频采集卡和水迷宫采集分析系统．Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验包括可视平台检测和隐藏平台检测两个部分．
在可视平台检测中，实验前一天为习惯阶段，让每只小鼠在没有平台的水迷宫中自由游泳１ｍｉｎ，以适应实验环境．测试过程中，在平台上固定一杆小旗（４ｃｍ×２ｃｍ），旗面位于水平面上方１５ｃｍ处．测试连续进行２ｄ，每天４次，每次间隔３０ｍｉｎ．训练时，使小鼠头朝向缸壁，分别于四个入水点入水，记录小鼠从入水到寻找并爬上可视平台所需时间即逃避潜伏期（Ｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙ），以及游泳速度（Ｓｗｉｍｓｐｅｅｄ）［９］．隐藏平台测试分为定位航行训练阶段（Ｐｌａｃｅｎａｖｉｇａｔｉｏｎｔｒａｉｎｉｎｇ）、第一次空间探索阶段（１ｓｔｓｐａｔｉａｌｐｒｏｂｅｔｅｓｔ）、反向定位航行训练阶段（Ｓｐａｔｉａｌｒｅｖｅｒｓａｌｌｅａｒｎｉｎｇ）和第二次空间探索阶段（２ｎｄｓｐａｔｉａｌｐｒｏｂｅｔｅｓｔ）．定位航行训练阶段为１４ｄ，每只每天４ 次，每次间隔３０ｍｉｎ．使小鼠面向池壁于水缸４ 个入水点入水，记录逃避潜伏期（Ｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙ）及所经过的路径（Ｌｅｎｇｔｈｏｆｓｗｉｍｐａｔｈ）．如果小鼠在６０ｓ内未找到平台，将其引至平台，逃避潜伏期记为６０ｓ．每次训练小鼠在平台停留３０ｓ．每只小鼠训练后，迅速将其洗净擦干，放回笼内．在此阶段平台置于任意一个象限的中央位置保持不变．每天４次逃避潜伏期的平均值作为该天的训练成绩，记为平均潜伏期，进行统计分析．然后小鼠被连续训练直至达到稳定的标准，即野生对照组能够连续４ｄ在２０ｓ之内到达平台．在定位航行训练阶段结束１ｄ后，把平台从水迷宫中撤走，进行第一次空间探索测试．每只有３次测试机会，操作与定位航行训练相似，每只让其自由探索６０ｓ，记录小鼠在各个象限的时间和路径．３次在平台象限的时间占总探索时间的百分比平均值作为记忆成绩，进行统计分析．在反向定位导航训练阶段，平台被移置对角象限的中心．每天操作方法同定位航行训练，总共训练４ｄ．第５天进行第二次空间探索测试，操作方法同第一次空间探索测试．所有行为学实验都是试验者在小鼠基因型未知的条件下进行．
１．４ 统计分析
疲劳转棒实验、第一次空间探索阶段和第二次空间探索阶段两组间比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ狋ｔｅｓｔ进行检验；可视平台检测、隐藏平台测试中定位航行测试和反向定位导航测试采用ＳＰＳＳ软件进行ＴｗｏｆａｃｔｏｒＡＮＯＶＡ
分析．犘＜０．０５为显著性差异，犘＜０．０１为极显著差异．数据均采用ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．表示．
２ 结 果
２．１ 疲劳转棒实验结果
在经历３ｄ的习惯阶段后，第４ 天进行５ｍｉｎ的检测．结果显示在转棒上爬行的总路程ＷＴ （１５４０．３９±２７７．１７）ｃｍ，Ｔｇ
（１２４６．２７±１７５．９３）ｃｍ，犘＝０．３８；见图１Ａ）和平均速
度上（ＷＴ （８．９３±０．６１）ｃｍ／ｓ，Ｔｇ
（８．３２±０．５２）ｃｍ／ｓ，犘＝０．４５；见图Ｂ），两组鼠没有显著的差异（见图１）．这表明转基因鼠的体能和运动协调能力正常．
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华东师范大学学报（自然科学版） ２０１０年
图１ 转基因组和同窝野生对照组在疲劳转棒实验中爬行的距离和平均速度
Ｆｉｇ．１ ＴｈｅｍｏｖｅｄｉｓｔａｎｃｅａｎｄａｖｅｒａｇｅｓｐｅｅｄｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｒｏｔａｒｏｄｔｅｓｔｉｎｂｏｔｈＴｇａｎｄ
ＷＴ ｍｉｃｅ
２．２ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验结果
２．２．１ 可视平台检测（Ｖｉｓｉｂｌｅｐｌａｔｆｏｒｍｔｅｓｔ）
在２ｄ共８次的可视平台检测中，两组小鼠之间在逃避潜伏期（犘＝０．３１；见图２Ａ）和游
泳的速度（犘＝０．３４；见图２Ｂ）上无统计学差异（见图２）．结果表明αＣａＭＫＩＩＦ８９Ｇ 在前脑
的过量表达，并没有对小鼠的视觉、运动能力和求生动机产生影响．图２ 转基因组和同窝野生对照组在水迷宫可视平台测试中逃避潜伏期和游泳的速度
Ｆｉｇ．２ ＴｈｅｅｓｃａｐｅｌａｔｅｎｃｙａｎｄｓｗｉｍｓｐｅｅｄｒｅｃｏｒｄｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｖｉｓｉｂｌｅｐｌａｔｆｏｒｍｔｅｓｔｉｎｂｏｔｈＴｇａｎｄ ＷＴ ｍｉｃｅ
２．２．１ 隐藏平台检测（Ｈｉｄｄｅｎｐｌａｔｆｏｒｍｔｅｓｔ）
在１４ｄ的定位航行训练中，随着训练的时间延长，转基因鼠和同窝对照野生型鼠逃避潜
伏期（见图３Ａ）和游泳的距离（见图３Ｂ）都呈显著下降趋势（犘＜０．０５，ＴｗｏｆａｃｔｏｒＡＮＯ
ＶＡ），并且两组之间训练成绩无统计学差异（犘＞０．０５；ＴｗｏｆａｃｔｏｒＡＮＯＶＡ）（见图３）．在第１５ｄ的空间探索测试中，转基因鼠和同窝对照野生型鼠在平台象限探索时间无显著差异
（ＷＴ （３５．１６±２．０３）％，Ｔｇ
（３４．４６±１．９５）％，犘＝０．８０；Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ狋ｔｅｓｔ），但它们在平台象限探索时间与在相邻象限探索时间相比有显著性差异（犘＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ狋ｔｅｓｔ）（见图４Ａ）．在反向定位航行训练中，两组鼠每天的训练成绩随着时间的增长显著升高（犘＜０．０５；ＴｗｏｆａｃｔｏｒＡＮＯＶＡ），并且两组鼠之间有显著性差异（犘＜０．０５；ＴｗｏｆａｃｔｏｒＡＮＯＶＡ）．在此阶段的第２天和第３天转基因鼠的逃避潜伏期（ｔｈｅ２ｎｄｄａｙ：ＷＴ （２４．９４±２．６４）ｓ，Ｔｇ（３２．２７±２．３４）ｓ，犘＝０．０４；ｔｈｅ３ｒｄｄａｙ：ＷＴ
（１９．８２±２．４３）ｓ，Ｔｇ（２７．７９±２．４２）ｓ，犘＝０．０２；见图３ Ａ）和游泳的距离（ｔｈｅ２ｎｄｄａｙ：ＷＴ （５３７．５９±５８．９０）ｃｍ，Ｔｇ
（７０６．６５±
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第２期安述明，等：αＣａＭＫＩＩ在前脑过量表达损伤小鼠灵活性学习能力
５５．０７）ｃｍ，犘＝０．０４；ｔｈｅ３ｒｄｄａｙ：ＷＴ （４４３．６２±５５．４２）ｃｍ，Ｔｇ
（６５１．４３±６０．４０）ｃｍ，犘＝０．０１；见图３Ｂ）都要显著的高于同窝野生对照组；在第二次空间探索测试中，两组鼠在平台象限探索时间也无显著性的差异（ＷＴ （２９．９２±１．１９）％，Ｔｇ
（２８．２９±０．８６）％，犘＝０．２５；Ｓｔｕｄｅｎｔ′ｓ狋ｔｅｓｔ）（见图４Ｂ）．
图３ 转基因组和同窝野生对照组在水迷宫(Barnes迷宫视频分析系统,Barnes迷宫,迷宫视频分析系统)定位导航训练和反向定位导航训练中逃避潜伏期和游泳的距离随天数的变化 |
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