精子分析系统（精子分析仪，精子质量分析仪）相关知识8

第3章 可选检测 3.1 精子多重缺陷的指标 《人类精液检验与处理实验室手册第五版》

发表者：郭军

3.4 附属性腺功能的生物化学分析
   现有多种反映附属性腺功能的生化指标，如前列腺分泌的柠檬酸、锌、γ-谷氨酰基转肽酶和酸性磷酸酶，精囊分泌的果糖和前列腺素，附睾分泌的游离L肉毒碱，甘油磷酸胆碱（GPC）和中性葡糖苷酶。
感染可能有时会导致在这些标志性的分泌物的减少。尽管可能存在感染，当前标志物的总量也可能在正常范围之内。某种感染也可能对分泌性上皮造成不可逆的损伤，因此在治疗以后分泌物仍可能处于低水平(Cooper 等., 1990a; von der Kammer等., 1991)。
●前列腺的分泌功能。精液中的锌，柠檬酸(Möllering 和 gruber，1966)或酸性磷酸酶(Heite 及 wetterauer 1979)的含量是前列腺分泌功能的一个可靠测量标准，且有这些标志物之间存在很好的相关性。锌的分光光度法测定见3.4.1节。
●精囊的分泌功能。精液中的果糖可反应精囊的分泌功能。其分光谱测量的估算方法见3.4.2节所述。
●附睾的分泌功能。L-左旋肉毒碱，甘油磷酸胆碱（GPC）和中性α-葡糖苷酶是临床常用的附睾标志物。在精浆中存在两种α-葡糖苷酶的异构体：其中主要的是中性α-葡糖苷酶，仅来源于附睾，另一种含量较少的酸性α-葡糖苷酶主要来源于前列腺。在反映附睾功能失调方面，中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱更特异、更敏感。测定方法见3.4.3节所述。
注释：所射精液中任何附属性腺分泌物的总含量均可反映该性腺的整体分泌功能（Eliasson, 1975）。这可以通过所测量到该附属性腺标志物的浓度乘以所射精液的体积来得到。
3.4.1 精浆中锌的测量
3.4.1.1 背景
通过比色分析方法测定血清锌含量的试剂盒也适用于测定精浆中的锌浓度。这种方法由Johnsen & eliasson (1987)改良形成，已有测定精液中锌的浓度的药盒。这种方法需要使用一个精确度为4µmol/l的96孔板测定仪(Cooper 等，1991)。当分光光度仪使用3ml或1ml的比色杯时，可以按比例调整精液和试剂的体积并在计算结果时做适当校正。
3.4.1.2 原理
化合物2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙氨）-苯酚(5-Br-PAPS)同锌结合会产生颜色变化。
其原理为5-Br-PAPS + Zn2+ → 5-Br-PAPS-Zn复合物，可吸收波长为560nm的可见光。
3.4.1.3 试剂
1.血清锌评估试剂盒是可以通过商业途径获得的。只需使用染色A试剂（规格为2 × 60 ml ）和染色B试剂（规格为1 × 30 ml）。
2.锌标准液(100 µmol/l)：向50 ml的净化水中溶解0.144 g的 ZnSO 4.7H2O，将 1 ml 上述溶液加入99 ml的水中稀释100倍。存放于室温或- 20 °C。
3.标准曲线：按照步骤2所述，溶解100µmol/l的锌标准液，将100 µmol/l 的锌标准液加水稀释为80，60，40，20和10 µmol/l另外五个的标准浓度。
4.显色剂的制备：显色剂A与B按4:1比例混合（每个96孔板约需25ml），该成色溶液可在室温下保持稳定2天，4 °C可保存1周。
5.冷冻用于内部质量控制的精浆 (参见3.4.1.4节，步骤1)。
3.4.1.4 操作
1.将精液分析后的剩余精液以1000g离心10分钟，收集无精子的精浆于- 20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用试样的提供标准。
2.去精子精浆解冻后置于混漩涡器上充分混匀。含高中低锌浓度的不同内部质量标本需同时检测。
3.将每份精浆样本制备成双份的稀释液：向两个1.5ml的试管中各加入300µl净化水及5µl精浆（使用正向置换型加样器），充分混合至少5秒钟。
4.向96孔读数板中加入步骤3中的双份稀释的精浆标本各40µl，还应包括双份空白（40µl）对照和双份的标准品。
5.向每个格中加入200µl显色试剂，并在96孔板振动器上震动混匀5分钟。
6.在560nm波长下读取结果，使用水作为空白对照调零校准。
3.4.1.5 计算
1.通过比较吸光度，自标准曲线上读取锌的浓度(mmol/l)。
2.所测得标本的值如果高于标准曲线上限，则应进一步稀释后重新测定这些标本。
3.结果需乘以稀释倍数61（5微升精浆以300微升水稀释），以获得未稀释的精浆中的锌浓度（mmol / L）。
4.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）× 100≤10％。如果未达到该种结果，应重新选取两等份的精浆重新进行检测。
5.乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中锌浓度（毫升），进而获得所射出精液中含有的锌的总量（μmol）。
3.4.1.6 参考值下限
每次射精中的锌的参考低值为2.4µmol/次（来自于库珀等，1991；和TG Cooper未发表的数据）。
3.4.2 果糖的测量
3.4.2.1 背景
以下方法是基于Karvonen & Malm (1955)所述，使用的是灵敏度为74μmol/ L的96孔板测定仪（Cooper 等，1990a）。精液与试剂的量可以为根据所使用的3毫升或1毫升比色杯按比例进行调整，在计算结果时做适当校正。
3.4.2.2 原理
在热和酸性条件的影响下，果糖会形成一种有色的吲哚复合物。
果糖+吲哚（加热酸化）复合物，在470nm波长测吸光度。
3.4.2.3 试剂
果糖测定的试剂盒可以通过商业途径获得，也可通过以下方式制备：
1.脱蛋白质的试剂1 (63 µmol/l的ZnSO4)：在100 ml净化水中溶解1.8 g 的ZnSO4•7H2O。
2. 脱蛋白质试剂2 (1 mol/l NaOH) ：在100 ml净化水中溶解NaOH 0.4 g。
3.染料试剂(浓度为16μmol/L的含有2μmol/吲哚的苯甲酸防腐剂）：200毫克的苯甲酸溶解于90毫升的纯净水中，在60 °C的水浴中振荡，将25毫克的吲哚溶解其中，并加净化水至100ml。过滤器（0.45微米孔径）过滤后于4 °C下储存。
4.果糖标准液（2.24 mmol / L）：在100毫升的纯净水中溶解D -果糖40毫克。分为等份，于4℃或冷冻条件下保存。
5.标准曲线：用被净化水稀释为2.24 mmol/l的标准液稀释产生1.12， 0.56， 0.28和0.14 mmol/l这另外四个标准点。
6.冰冻用于内部质量控制的精浆 (见3.4.2.4节，步骤1)。
3.4.2.4 操作
1.使精 子分析仪进行液分析后的剩余精液以1000g离心10分钟，收集无精子的精浆于- 20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用试样的提供标准。
2.解冻去精子精浆并在振荡器上充分混匀。将用于内部质量控制的标本也按照上述方法解冻混匀。
3.将每份精浆样本制备成双份的稀释液：向两个1.5ml的试管中各加入300µl净化水及5µl精浆（使用正向置换型加样器），充分混合。
4.脱去蛋白质：向稀释的样品55µl中加入加12.5μl浓度为63 µmol/l的ZnSO4和12.5µl浓度为0.1 mol/l 的NaOH溶液，混匀，室温下静置15分钟，然后以8000g离心5分钟。
5.吸取50 µl上清液样品加入到各个试管中，还应包括双份空白（50µl的水）对照和双份的标准品。
6.加50µl吲哚试剂到每支管中并混匀。
7.加0.5 ml的浓(32% v/v)盐酸(HCl)到每个样品中，加盖自封口磨砂实验室用瓶塞，并且小心地在通风橱中混匀。
8.在50 °C的热水锅中加热20分钟。混匀，在冰水中冷却15分钟。
9.在通风橱中用移液器仔细加入到96孔板250微升。
10.为保护实验室的酸分光光度计，以96孔透明胶薄膜板密封。
11.在470nm波长读取结果，使用水作为空白对照进行调零。
3.4.2.5 计算
1.通过比较吸光度的数值，从标准曲线中读取样本的果糖浓度(mmol/l)。
2.所测得标本的值如果高于标准曲线上限，则应进一步稀释后重新测定这些标本。
3.结果应乘以每个样品的稀释倍数16（5微升精浆加入75微升的水和沉淀蛋白剂稀释），以获得稀释后精浆的果糖浓度（mmol / L）。
4.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）× 100≤10％。如果未达到该种结果，应重新选取两等份的精浆重新进行检测。
5.乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中锌浓度（毫升），进而获得所射出精液中含有的锌的总量（μmol）。
3.4.2.6 参考值下限
每次射精中的锌的参考值下限为13µmol/次（来自于Cooper等，1991；和TG Cooper未发表的数据）。
注释：精液中果糖含量低是射精管梗阻，先天性双侧输精管缺如(de la Taille 等，1998; Daudin等， 2000; von Eckardstein等，2000)，部分逆行性射精以及雄激素不足的特征。
3.4.3 精浆中中性α-葡萄糖苷酶的测定
3.4.3.1 背景
精液中含有两种α-葡萄糖苷酶同工酶，其中一种产生自附睾，另一种酸性的同工酶由前列腺产生。后者可以由钠十二烷基的硫酸盐(SDS)选择性地抑制(Paquin等，1984)，从而保证对中性葡糖苷酶的测量，以反映附睾的功能。考虑到同非糖苷酶相关的底物的崩解，通过使用抑制剂澳栗精胺，可使分析用的样本的敏感度更高。下述方法需要灵敏度为1.9 mU/ml的96孔测定仪（Cooper 等，1990b）。精液与试剂的量可以为根据所使用的3毫升或1毫升比色杯按比例进行调整，在计算结果时做适当校正。
3.4.3.2 原理
萄葡糖苷酶可将合成的吡喃葡萄糖苷底物转化为在碳酸钠条件下呈现黄色的P-硝基酚。P-硝基酚-α-吡喃葡萄糖苷（α-葡萄糖苷酶）→P-硝基酚（碳酸钠）→可吸收405nm可见光。
3.4.3.3 试剂
精液中附睾分泌的中性α-葡萄糖苷酶的测量试剂盒是可以通过商业途径得到的。只推荐使用包括SDS和澳栗精胺的试剂盒来进行该项精液中的酶检验。另外，尚需准备以下试剂：
1.缓冲液1 (0.2 mol/l的磷酸盐，酸碱度6.8) ： 在100 ml净化水中溶解4.56 g 的K2HPO4•3H2O，之后在另一100ml净化水中溶解2.72 g 的KH2PO4。将两种溶液等体积充分混匀，直至pH达到6.8。
2.缓冲液2 ： 在100 ml缓冲液1中溶解1 g的SDS。SDS存贮在4 °C时会沉淀析出，但是稍经加热即会重新溶解。
3．显色试剂1 (用于终止反应，0.1 mol/l碳酸钠) ： 在500 ml水中溶解6.20 g的Na2CO3•H2O。
4．显色试剂2 ： 在100 ml显色试剂1中溶解0.1 g 的SDS。
5.P-硝基酚葡萄糖甙底物（PNPG）（5mg/ml）：在20ml缓冲液2中溶解0.1克的PNPG，在电炉上加热至约50℃，搅拌溶解10分钟。仍可能会有少量晶体未溶解。应在37℃的条件下使用试剂。每一次分析均应使用新制备的试剂。
6.用于空白对照的葡萄糖苷酶抑制剂（奥粟精胺，10 mmol / L）：在10毫升的净化水中溶解18.9mg的澳栗精胺，稀释10倍，即加纯净水稀释成1 mmol/l的工作液。将样品按照1毫升分装，冻存于-20℃下。
7.反应产生的P-硝基酚(PNP)的标准曲线(5 mmol/l) ： 在100 ml净化水中溶解69.5mg的PNP，如有需要可加热。存放于加盖的避光铝箔瓶或棕色玻璃瓶中，在4℃下保存。每三个月制备一次新的标准液。
8.制备标准曲线(在孵化后的1小时内进行) ：将400 µl浓度为5 mmol/l的PNP储备液加入到10ml的容量瓶中，用显色试剂2 (200 µmol/l)定容至10ml。用显色试剂2稀释200µmol/l标准液产生160，120，80和40µmol/l的PNP的另四个标准点。
9.冷冻用于内部质量控制的精浆 (参见3.4.1.4节，步骤1)。
3.4.3.4 操作
1.以1000g离心精液分析后的剩余样品10分钟，收集无精子的精浆于- 20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用试样的提供标准。
2.解冻去精子精浆并在振荡器上充分混匀。将用于内部质量控制的标本也按照上述方法解冻混匀。
3.用正向的置换型加样器将双份15µl的精液标本加入1.5ml试管中。包括双份空白（15 µl水）及双份用于内部质控的精液样本。
4.向其中两份含质控样本中加入8µl浓度为1 mmol/µl的奥粟精胺以提供空白精浆值。
5.37℃条件下，向每支试管中添加100µl的PNPG底物。
6在37 °C下震荡混匀，孵化2个小时(该反应的关键是准确的控制反应的时间和温度)。
7.2小时后向每支试管中加1 ml显色试剂1，充分混匀后终止孵育。
8.每管中移取250 µl样品和标准品，加入96孔板中。
9.使用水作为空白对照进行调零，60分钟内用96孔板测定仪在405nm波长下读取结果。
3.4.3.5 计算
1.通过比较吸光度从标准曲线中读取样本的PNP浓度（µmol/ L）。
2.所测得标本的值如果高于标准曲线上限，则应进一步稀释后重新测定这些标本。
3.乘以修正系数（0.6194，见注）以获得未稀的精浆样本中的中性葡萄糖苷酶的浓度（IU/l）。
4.从每个待测样本中减去经奥粟精胺处理的精浆空白对照组（IU/l）的活性值以获得修正（同葡萄糖苷酶相关的）活性值。
5.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）× 100≤10％。如果未达到该种结果，应重新选取两等份的精浆重新进行检测。
6.乘以一次射精的精液体积（ml），得到每次射出的精液中葡萄糖苷酶的总活性（mU）。
注： 一个国际单位(IU)的葡糖苷酶活性被定义为在37℃下1分钟内单位产物（1µmol）的产量。本检验中，其活性分析来源于总量为1.115µl的精浆中的15µl，在120分钟里的产量，故修正因数为（1115/15）/120=0.6194
3.4.3.6 参考范围
中性葡糖苷酶的参考值下限为每次射精≥20mU（来自于Cooper等， 1991；和TG Cooper未发表的数据）。
　

本公司1998年开发了精子分析仪（精子分析系统，精液分析仪，精子质量分析仪，鱼的精子质量分析仪，马的精子分析系统，牛的精子分析仪，羊的精子质量分析仪， 猪的精子分析仪，狗的精子质量分析仪，猫的精子分析仪等动物精子质量分析仪